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現(xiàn)在檢水多采用微生物培養(yǎng)法，常見所檢的細菌有軍團菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。現(xiàn)在，qPCR方法更多的可用于水質檢測以及上述微生物的定量檢測。
可以采用德國MB公司的水中微生物DNA提取試劑盒（英文名：AquaScreen® Fast Extract）用于從水樣中提取微生物DNA。該試劑盒遵循ISO/TS 12869:2012的設計要求。提取的DNA可用于下游的PCR或qPCR檢測。
一、適合的樣本：
包括飲用水、浴池水、泳池水及廢水等。
二、工作原理：
該試劑盒采用0.4μm濾膜截獲微生物，然后微生物被加入到濾膜上的離子活性劑和促溶劑裂解。隨后進行DNA抽提。
DNA抽提由四步組成：1. 菌體裂解
2. DNA與離心柱的特異結合
3. 祛除殘留污染物和抑制劑
4. DNA的洗脫
整個過程大約30分鐘。
三、產品組成：
四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器：
1. 水過濾設備（濾器、真空泵等）
2. 無水乙醇
3. 反應管（1.5ml或2ml）
4. 離心機
5. 恒溫儀
6. 移液器及帶濾芯吸頭（100ml和1000ml）
7. 恒溫箱
五、樣本制備須知：
1. 飲用水、浴池水、泳池水及廢水可作為樣本。樣本性狀會影響結果的可靠性，并需要與ISO的水樣采集指南一致（ISO Norm 5667-1至5667-10）。
2. 水樣應在2-8°C保存，在采集的2天內檢測。不推薦使用防腐劑，因為會使菌體裂解，而濾膜只能截留完整的菌體。
3. 若水樣中有懸浮顆粒或固定揮發(fā)性成分，則需先用濾紙過濾。
4. 樣本不能離心。
5. 該試劑盒所需樣本體積建議為1000ml。樣本體積少應為100ml。
6. 該試劑盒不會截獲水中游離的DNA。
7. 該試劑盒不能區(qū)分“活的可培養(yǎng)微生物”與“活的不可培養(yǎng)微生物”。
六、操作注意事項：
七、樣本制備步驟：
（一）操作步驟概覽
（二）操作步驟詳解
步驟1. 樣本過濾
1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。
1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。
步驟2. 菌體裂解
* 提前準備：預先將恒溫儀設置到70℃，將恒溫箱設置到37℃。
2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉放置到試劑盒提供的Incubation Dish（平皿）中。
2.2 吸取2ml lysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。
2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。
2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。
2.5 將平皿中的400 μl裂解液轉移至Incubation Tube（孵育管），70 °C孵育10分鐘。
2.5a可選項：剩余裂解液可再取400μl用于DNA抽提，以獲得更多的DNA樣本。
2.6 樣本短暫離心，并加入400 μl Binding Buffer（結合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請勿離心樣本，并立即進行下一步。
步驟3. DNA提取
* 提前準備：（1）Wash Buffer 1（洗液1）和Wash Buffer 2（洗液2）第yi次使用前，用無水乙醇復溶（請參見瓶上標簽）
（2）將恒溫儀設置到70℃，并將Elution Buffer（洗脫液）放在上面預熱。
3.1 將步驟2.6中的混合液（~800 μl）轉移到Collection Tube（收集管）內的Spin Column（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。
3.2 離心柱離心≥10000 × g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。
3.2a 可選擇：在步驟2.5a中，多取的一份樣本重復以上操作，不用換離心柱。
3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。
3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個新的收集管中。
3.5大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。
3.6棄掉收集管。將離心柱插入到試劑盒提供的Sample Storage Tube（樣本保存管）中。
3.7吸取60μl已70℃預熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應全部覆蓋洗脫液。
3.8室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。
3.9樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲存在2~8℃，可存放1周。長期儲存是在≤-18℃。
八、樣本中的細菌數(shù)量計算
樣本中的細菌定量需使用PCR定量標準品和qPCR檢測試劑盒（推薦使用德國MB的PCR定量標準品和AquaScreen®qPCR檢測試劑盒，詳見“九、水中細菌精zhun測定，還需要的相關試劑”）
計算公式：基因組拷貝數(shù)/反應 × 比例因子× 校正因子× （1000/樣本體積（ml））
= 微生物數(shù)量/升
注：
1. 樣本中的基因組拷貝數(shù)：可通過標準曲線定量
2. 比例因子：取1份400ml裂解液，比例因子=5
取2份400ml裂解液，比例因子=2.5
取3份400ml裂解液，比例因子=1.67
3. 校正因子：60ml洗脫液中取10ml用于qPCR反應，校正因子=6
九、水中細菌精zhun測定，還需要的相關試劑：
總之，傳統(tǒng)水質檢查需要2-3天，qPCR法只需要2-3個小時，提取DNA只需要大約半個小時，更精zhun，更快捷。以上信息供參考，感謝締一生物提供相關內容。
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